解淀粉芽胞杆菌hemX基因缺失对血红素合成的影响

血红素是一种广泛存在于生物体中的卟啉类化合物,具有多种生理功能。解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)具有易于培养、分泌表达能力较强等特点,是一种重要的工业菌株。为了筛选血红素合成的最优出发菌株,以不添加和添加5-氨基乙酰丙酸(5-aminolevulinic acid, ALA)的方式,对实验室保藏菌株进行筛选,发现不添加ALA时,菌株BA、BAΔ6、BAΔ6ΔsigF的血红素产量无明显差别;然而添加ALA后,BAΔ6ΔsigF的血红素产量和比生产能力均为最高,分别达到200.77μmol/L和615.70μmol/(L·g DCW)。因此,以BAΔ6ΔsigF为出发菌株,敲除编码细胞色素组装蛋白HemX的hemX基因,探究其在血红素合成途径中的作用,发现敲除菌株发酵液明显变红,且生长未受到明显影响;摇瓶发酵12 h时ALA浓度最高,为82.13 mg/L,略高于对照的75.11 mg/L;不添加ALA时,血红素产量和比生产能力分别为对照的1.99倍和1.45倍;添加ALA后,血红素产量和比生产能力分别为对照的2.08倍和1.72倍;实时定量荧光PCR...     

来源于嗜热氢化杆菌的新型对苯二甲酸双(羟乙)酯水解酶的表达纯化与酶学性质

石化来源的聚对苯二甲酸乙二酯(polyethylene terephthalate,PET)被广泛用于矿泉水瓶、食品包装和纺织品等领域,因其在自然界中不易分解,大量使用后的PET废弃物造成了严重的环境污染与资源浪费。使用生物酶法对PET废弃物进行解聚,并对解聚产物进行升级循环利用是进行塑料污染治理的重要方向之一,其中关键的是PET水解酶的解聚效率。对苯二甲酸双(羟乙基)酯(bis(hydroxyethyl)terephthalate,BHET)是PET生物酶解的中间产物,其累积是限制PET水解酶催化效率的一个重要因素,BHET水解酶和PET水解酶的联用能提升PET的整体水解效率。来源于嗜热氢化杆菌(Hydrogenobacter thermophilus)的双烯内酯酶(HtBHETase)对BHET有显著水解效果,将该酶在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行重组表达并纯化后,对其酶学性质进行了研究。结果显示,HtBHETase对短碳链的酯类如对硝基苯酚乙酸酯催化活性较高,HtBHETase以BHET为底物时的最适反应pH值和最适反应温度分别为5.0和55℃;该酶有较好的热稳定性,经80℃的条件处理1 h仍能保持80%以上活性,显示出了良好的热稳定性,HtBHETase有在PET塑料生物解聚中使用的潜力,本研究为推动生物酶法降解PET提供了新的参考。     

LaeA在丝状真菌次级代谢、生长发育和其他重要生物过程中的作用

LaeA是在构巢曲霉中首次鉴定的一种全局调控因子,其同源蛋白在丝状真菌中广泛存在,具有高度的保守性。LaeA及其同源蛋白序列存在S-腺苷甲硫氨酸结合基序,是一种甲基转移酶,可能影响组蛋白修饰,导致染色体结构的改变,进而调控一系列基因的表达。大量研究表明,LaeA及其同源蛋白参与调控丝状真菌多种次级代谢产物的生物合成,影响丝状真菌的生长发育和形态分化,甚至在丝状真菌生产有机酸和一些工业酶的过程中也发挥着重要作用。本文综述了LaeA及其同源蛋白的作用机制,以及该蛋白在丝状真菌次级代谢、生长发育和其他重要生物过程中的作用,并对存在的问题及应用前景进行讨论与展望。     

谷氨酸棒杆菌碱基编辑的条件优化

近年来,基于CRISPR/Cas9的碱基编辑技术因其具有不产生DNA双链断裂、无需外源DNA模板、不依赖宿主同源重组修复的优势,已经逐渐发展成为一种强大的基因组编辑工具,在动物、植物、酵母和细菌中得到了开发和应用。研究团队前期已在重要的工业模式菌株谷氨酸棒杆菌中开发了一种多元自动化的碱基编辑技术MACBETH,为进一步优化该方法,提高碱基编辑技术在谷氨酸棒杆菌中的应用效率,本研究首先在谷氨酸棒杆菌中构建了基于绿色荧光蛋白(GFP)的检测系统:将GFP基因的起始密码子ATG人工突变为ACG,GFP无法正常表达,当该密码子的C经编辑后恢复为T,即实现GFP蛋白的复活,结合流式细胞仪分析技术,可快速衡量编辑效率。然后,构建针对靶标位点的碱基编辑工具,经测试,该位点可成功被编辑,在初始编辑条件下碱基编辑效率为(13.11±0.21)%。在此基础上,通过对不同培养基类型、诱导初始OD600、诱导时间、诱导物浓度进行优化,确定最优编辑条件是:培养基为CGXII,初始OD600为0.05,诱导时间为20 h,IPTG浓度为0.01 mmol/L。经过优化,编辑效率达到(30.35±0.75)%,较初始条件提高了1.3倍。最后,选取原编辑条件下编辑效率较低的位点,进行了优化后编辑条件下的编辑效率评估,结果显示,不同的位点在最优编辑条件下的编辑效率提高了1.7–2.5倍,进一步证实该优化条件的有效性及通用性。研究结果为碱基编辑技术在谷氨酸棒杆菌中更好的应用提供了重要的参考价值。     

异化铁还原细菌LQ25还原重金属Cr (VI)的特性研究

[背景] 异化铁还原细菌能够在还原Fe （III）的同时将毒性较大的Cr （VI）还原成毒性较小的Cr （III）,解决铬污染的问题。[目的] 基于丁酸梭菌（Clostridium butyricum） LQ25异化铁还原过程制备生物磁铁矿,开展异化铁还原细菌还原Cr （VI）的特性研究。[方法] 构建以氢氧化铁为电子受体和葡萄糖为电子供体的异化铁培养体系。菌株LQ25培养结束时制备生物磁铁矿。设置不同初始Cr （VI）浓度（5、10、15、25和30 mg/L）,分别测定菌株LQ25对Cr （VI）还原效率以及生物磁铁矿对Cr （VI）的还原效率。[结果] 菌株LQ25在设置的Cr （VI）浓度范围内都能良好生长。当Cr （VI）浓度为15 mg/L时,在异化铁培养条件下,菌株LQ25对Cr （VI）的还原率为63.45%±5.13%,生物磁铁矿对Cr （VI）的还原率为87.73%±9.12%,相比菌株还原Cr （VI）的效率提高38%。pH变化能影响生物磁铁矿对Cr （VI）的还原率,当pH 2.0时,生物磁铁矿对Cr （VI）的还原率最高,几乎达到100%。电子显微镜观察发现生物磁铁矿表面有许多孔隙,X-射线衍射图谱显示生物磁铁矿中Fe （II）的存在形式是Fe （OH）₂。[结论] 基于异化铁还原细菌制备生物磁铁矿可用于还原Cr （VI）,这是一种有效去除Cr （VI）的途径。     

枯草芽胞杆菌基因组删减对异源酶表达影响的研究进展

枯草芽胞杆菌作为一种遗传背景清晰、基因编辑成熟的革兰氏阳性菌,是多种重要工业酶的生产宿主。随着转录组、蛋白质组、代谢组等多组学测序和分析技术的发展,通过合理设计简化枯草芽胞杆菌基因组,减少细胞内冗余的调控和代谢网络,使得细胞更精简且便于控制,展现出了枯草芽胞杆菌作为异源酶表达宿主细胞的应用潜力。本文简要综述了枯草芽胞杆菌基因组删减的研究进展,归纳了必需基因的确定方法,重点介绍了枯草芽胞杆菌通过删减基因组提升异源酶表达的研究进展及删减策略,充分展示了枯草芽胞杆菌基因组删减在构建异源酶表达底盘细胞中的重要作用。     

异源表达多巴脱羧酶促进大肠杆菌从头合成多巴胺

多巴胺是多种天然抗氧化药物生物合成的前体物质,在人体内作为神经递质调控中枢神经系统的多种生理功能,常用于多种类型休克的临床治疗。目前,通过微生物合成技术已经实现了多巴胺的从头合成,但是合成效率很低。针对该问题,在左旋多巴 (l-DOPA) 大肠杆菌工程菌基础上,利用不同拷贝数质粒表达野猪Sus scrofa来源的多巴脱羧酶基因Ssddc,实现了葡萄糖到多巴胺的生产。为了进一步提高多巴胺合成效率,从100个候选基因中筛选出5个多巴脱羧酶基因进行测试,其中来源于人Homo sapiens多巴脱羧酶基因Hsddc的工程菌摇瓶发酵的多巴胺产量最高,达到3.33 g/L;而来源于果蝇Drosophila melanogaster多巴脱羧酶基因Dmddc的工程菌摇瓶发酵的左旋多巴残余量最低,仅有0.02 g/L;这两株工程菌分批补料发酵表明,多巴胺的产量可以分别达到13.3 g/L和16.2 g/L,左旋多巴残余量分别是0.45 g/L和0.23 g/L。将多巴脱羧酶基因Dmddc和Ssddc分别整合到基因组上,获得遗传稳定的工程菌,在分批补料发酵条件下,多巴胺产量最高达到17.7 g/L,是目前国内外报道的最高产量。     

利用CRISPR-Cas9技术失活黑曲霉中果胶酶基因及突变株性能评价*

我国果胶酶制剂使用广泛但专一性不高,高效、专一的果胶酶制剂在市场上仍然匮乏。利用基因工程技术改造果胶酶生产菌株——黑曲霉来生产单一成分的果胶酶成为解决果胶酶应用需求的一种有效方案。构建一种高效的CRISPR-Cas9基因编辑技术,可为构建高产单一性果胶酶的黑曲霉底盘菌株提供有效的基因编辑工具。首先敲除产果胶酶黑曲霉基因组上的pyrG基因构建尿嘧啶营养缺陷型菌株AnΔpyrG,并在AnΔpyrG菌株的pyrG基因位点定点整合Cas9基因表达盒和pyrG基因表达盒,构建组成型表达Cas9基因的黑曲霉菌株AnCas9,再构建含有gpdA启动子、锤头结构核酶、HDV核酶的稳定性表达sgRNA的pLM2-sgRNA质粒,建立CRISPR-Cas9基因编辑体系。利用该技术失活AnCas9菌株中的2个聚半乳糖醛酸酶基因4978020和4983861来检测构建的CRISPR-Cas9基因编辑效率并检测4978020基因功能缺失菌株的表型变化和产酶变化,结果表明果胶酶基因编辑效率大于50%,AnΔ4978020的表型和果胶酶酶活性与出发菌株均无明显变化。在黑曲霉中成功构建了高效的Cas9基因编辑技术,4978020基因功能缺失也不影响菌株表型,为构建高产单一性果胶酶黑曲霉底盘菌株奠定基础。     

细胞色素P450酶的结构、功能与应用研究进展

细胞色素P450 (cytochrome P450,CYP)酶是广泛存在于微生物、动植物及人体中与膜结合的血红蛋白类酶,具有氧化、环氧化、羟化、去甲基化等多种生物催化活性。CYP酶在药物、类固醇、脂溶性维生素和许多其他类型化学物质的代谢中具有重要作用,其在异源物质的解毒、药物相互作用和内分泌功能等领域的研究是热点问题。本综述对CYP的结构、功能、临床应用与开发前景进行了概述,并对其最新的研究现状和发展前景进行探讨。     

来源于麦氏喙枝孢霉的玉米赤霉烯酮水解酶在毕赤酵母中的高效表达及活性分析

【背景】玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)及其衍生物是一群具有雌激素活性的霉菌毒素,广泛存在于被霉菌污染的谷物中,造成食品业和畜牧业的巨大损失。利用专一性高的水解酶进行生物转化可有效去除玉米赤霉烯酮。【目的】构建高效表达玉米赤霉烯酮水解酶的酵母系统,以促进玉米赤霉烯酮水解酶的研究和工业应用。【方法】将来源于麦氏喙枝孢霉(RhinocladiellamackenzieiCBS650.93)的Rmzhd基因转入毕赤酵母中,筛选获得高效表达菌株,通过高效液相色谱分析发酵液中重组酶的性质。【结果】发酵液中Rm ZHD对ZEN的酶活力为16.67 U/m L,对α-ZOL的酶活力为9.85 U/m L。SDS-PAGE检测表达产物的分子量,与理论值30.7k D符合,且发酵上清液蛋白纯度高。Rm ZHD的最适p H值为9.6,最适温度为45°C,并具有较好的耐热性。【结论】研究结果为玉米赤霉烯酮水解酶的异源表达及其潜在的工业应用提供了一定的指导。